Identificación de secuencias microsatélites en cultivos nativos para el desarrollo de marcadores moleculares específicos

資料紀錄

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版本

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如何引用

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EDUARDO M, BUITRON J (2024). Identificación de secuencias microsatélites en cultivos nativos para el desarrollo de marcadores moleculares específicos. Version 1.5. Ninguna organización. Occurrence dataset. https://patrimonio.ambiente.gob.ec/iptmae_permisos/resource?r=librerias_ssr&v=1.5

權利

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關鍵字

Librerías; chocho; jícama; arracacha; SSR; desarrollo de marcadores.

聯絡資訊

地理涵蓋範圍

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分類群涵蓋範圍

N/A

時間涵蓋範圍

計畫資料

El Dpto.de Biotecnología ha aplicado la tecnología NGS para la identificación y desarrollo de marcadores útiles para el genotipaje de cultivos nativos (Morillo et al., 2016; Morillo & Buitrón, 2017). Los cultivos seleccionados por su importancia e interés científico en este proyecto fueron: Chocho o tarwi (Lupinus mutabilis), Arracacha o zanahoria blanca (Arracacia xanthorrhiza), Jícama o yacón (Smallanthus sonchifolia). Con la secuenciación de los ADNs se obteuvieron banco de secuencias SSR explotables para el desarrollo de marcadores moleculares en cada cultivo.

參與計畫的人員:

取樣方法

Para cada cultivo (chocho, arracacha y jícama) se obtuvo ADN genomica de alta calidad

方法步驟描述:

1. Identificación por NGS de secuencias microsatélites en Lupinus mutabilis, Arracacia xanthorrhiza y Smallanthus sonchifolia Extracción de ADN genómico: se utilizó ADN genómico extraído de un cultivar comercial para chocho y dos clones de las colecciones de zanahoria blanca y jícama del INIAP. Se probaron varios protocolos de extracción para seleccionar el método que permita obtener la mejor calidad de ADN genómico para la secuenciación por NGS.
2. Preparación de librerías genómicas: Se utilizó el kit Nextera DNA Sample (Ref. ILLUMINA Cat. No. GAO9115), cuyo procedimiento comprendió las siguientes etapas: a. Fragmentación del ADN genómico: se utilizó 50 ng de ADN genómico no degradado (ratio de absorbancia 260/280 nm entre 1.8 y 2) para la incorporación de tags específicos y secuencias tipo barcodes que permiten su posterior amplificación. b. Amplificación por PCR: para la amplificación de fragmentos se utilizáron adaptadores específicos proveídos en el kit NEXTERA (BARCODE combinations) c. Normalización de librerías: se normalizó la concentración de ADN y se visualizó la calidad de fragmentos generados previa su secuenciación con la tecnología ILLUMINA. Previa la normalización se realizó una cuantificación de las librerías qPCR en un lector KAPA-BIOSYSTEMS. d. Control de calidad de librerías: se utilizaró el kit del BIOANALIZER (AGILENT TECH 2100) el cual utiliza un chip para estimar el tamaño y concentración de fragmentos de las librerías de ADN. Se utilizó el kit de KAPA-BIOSYSTEMS (Library Quantification Kit) para obtener una cuantificación precisa de las bibliotecas previa su secuenciación NGS.
3. Secuenciación por NGS: se utilizó la tecnología de ILLUMINA con el equipo MISEQ para la secuenciación de las librerías obtenidas. Se utilizó un cartucho de 500 (2 x 250) para obtener lecturas en Paired ends (doble sentido) para cada librería de DNA de cada cultivo.
4. Análisis bioinformático: los datos de las corridas se almacenaron en el servidor del CIRAD. El análisis inició con la obtención de los archivos de salida del secuenciador MISEQ los cuales se generan en formato FastQ comprimidos (*.fastq.gz) para cada libreria analizada. Para cada librería se obtuvo dos archivos de salida FastQ (una para cada sentido). Se realizó un análisis FastQC para el Control de calidad de los datos NGS generados en la secuenciación. De este análisis se generó para cada librería un reporte con estadísticas y gráficos de parámetros tales como Calidad de secuencia por base (per base sequence quality-PbSQ), Contenido de secuencia por base (per base sequence content-PbSC), secuencias sobre representadas (overrepresented sequences-OS). Una vez realizado el control de calidad de datos, se utilizó un pipeline en LINUX para la identificación de contigs con motifs SSR explotables en las librerías de ADN secuenciadas. Los resultados crudos (en formato FASTQ) se descargaron en el clúster de cálculo con la ayuda de los programas WING-X y PUTTY. En PUTTY se corríeron scripts para el ensamblaje de contigs usando el programa ABYSS y un pipeline para la búsqueda de motifs microsatélites con el programa MISA. Se incorporó como criterio de búsqueda: la búsqueda de motifs microsatélites con dos a cinco unidades de repetición y el tamaño de las secuencias flanqueantes de al menos de 100 pb a cada lado de la secuencia motif para el diseño de primers.

引用文獻

1. Morillo E, Buitron J, Limongi R, Vignes H and Argout X. (2016). Characterization of microsatellites identified by Next Generation Sequencing in the Neotropical tree Handroanthus billbergii (Bignoniaceae). Applications in Plant Sciences 4(5): http://dx.doi.org/10.3732/apps.1500135
2. MORILLO E. y BUITRON J. 2017. Generación de la tecnología de marcadores moleculares microsatélites para el genotipaje de especies nativas de interés. In. Memorias científicas del Congreso Internacional de Agricultura Sustentable. Pg. 31. UTC, Ecuador

額外的詮釋資料