Description
El INIAP ha incursionado en el desarrollo de esta tecnología en cultivos y especies nativas. En este proyecto se aplicó la tecnología NGS para la identificación de secuencias SSRs en cultivos andinos de interés con el fin de desarrollar marcadores moleculares específicos. Los cultivos seleccionados por su importancia e interés científico: Chocho o tarwi (Lupinus mutabilis), Arracacha o zanahoria blanca (Arracacia xanthorrhiza), Jícama o yacón (Smallanthus sonchifolia). La plataforma de Secuenciación y Genotipaje del CIRAD en Montpellier prestó el servicio de secuenciación en ILLUMINA aplicando la tecnología Shortgun, el mismo que inició con la estandarización de un método de extracción de ADN genómico en los tres cultivos. El equipo MISEQ utilizado produjo hasta 30 millones de lecturas en pair-end generando hasta 7 Gbases de secuencias en una corrida. El análisis bioinformático incluyó el uso de pipelines específicos (MISA)para la identificación de contigs con secuencias SSR explotables en las librerías para cada cultivo. El producto obtenido de este proyecto es un banco de secuencias SSR con primers y motif obtenido en el ADN secuenciado, a partir del cual el INIAP realiza el screening y validación de nuevos marcadores moleculares para los cultivos indicados.
Data Records
The data in this occurrence resource has been published as a Darwin Core Archive (DwC-A), which is a standardized format for sharing biodiversity data as a set of one or more data tables. The core data table contains 6 records.
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Versions
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How to cite
Researchers should cite this work as follows:
EDUARDO M, BUITRON J (2024). Identificación de secuencias microsatélites en cultivos nativos para el desarrollo de marcadores moleculares específicos. Version 1.5. Ninguna organización. Occurrence dataset. https://patrimonio.ambiente.gob.ec/iptmae_permisos/resource?r=librerias_ssr&v=1.5
Rights
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This work is licensed under a Creative Commons Attribution Non Commercial (CC-BY-NC 4.0) License.
GBIF Registration
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Keywords
Librerías; chocho; jícama; arracacha; SSR; desarrollo de marcadores.
Contacts
- Originator
- INVESTIGADOR PRINCIPAL (RESPONSABLE TÉCNICO)
- Originator
- TÉCNICO
- Point Of Contact
- DIRECTOR EJECUTIVO
- Av. Eloy Alfaro N30-350 y Av. Amazonas Edificio MAGAP – 4to. piso
- Point Of Contact
- DIRECTOR DE INVESTIGACIONES (2020)
Geographic Coverage
PICHINCHA
| Bounding Coordinates | South West [-90, -180], North East [90, 180] |
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Taxonomic Coverage
N/A
| Kingdom | Plantae |
|---|---|
| Phylum | Tracheophyta |
| Class | Magnoliopsida, Magnoliopsida |
| Order | Fabales, Apiales, Asterales |
| Family | Asteraceae, Apiaceae, Fabaceae |
Temporal Coverage
| Start Date / End Date | 2020-10-20 / 2022-04-20 |
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Project Data
El Dpto.de Biotecnología ha aplicado la tecnología NGS para la identificación y desarrollo de marcadores útiles para el genotipaje de cultivos nativos (Morillo et al., 2016; Morillo & Buitrón, 2017). Los cultivos seleccionados por su importancia e interés científico en este proyecto fueron: Chocho o tarwi (Lupinus mutabilis), Arracacha o zanahoria blanca (Arracacia xanthorrhiza), Jícama o yacón (Smallanthus sonchifolia). Con la secuenciación de los ADNs se obteuvieron banco de secuencias SSR explotables para el desarrollo de marcadores moleculares en cada cultivo.
| Title | Identificación de secuencias microsatélites en cultivos nativos para el desarrollo de marcadores moleculares específicos |
|---|---|
| Identifier | MAAE-DNB-CM-2020-0142 |
| Study Area Description | La investigación se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular del Departamento de Biotecnología EESC, Provincia de Pichincha, cantón Mejía. Para la secuenciación con ILLUMINA se contó con la colaboración del laboratorio de Genotipaje y Secuenciación del CIRAD (UMR AGAP, Montpellier, Francia). |
The personnel involved in the project:
- Content Provider
Sampling Methods
Para cada cultivo (chocho, arracacha y jícama) se obtuvo ADN genomica de alta calidad
| Study Extent | La investigación se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular del Departamento de Biotecnología INIAP-EESC, Provincia de Pichincha, cantón Mejía. La secuenciación con ILLUMINA se realizó en el laboratorio de Genotipaje y Secuenciación del CIRAD (UMR AGAP, Montpellier, Francia). |
|---|
Method step description:
- Identificación por NGS de secuencias microsatélites en Lupinus mutabilis, Arracacia xanthorrhiza y Smallanthus sonchifolia Extracción de ADN genómico: se utilizó ADN genómico extraído de un cultivar comercial para chocho y dos clones de las colecciones de zanahoria blanca y jícama del INIAP. Se probaron varios protocolos de extracción para seleccionar el método que permita obtener la mejor calidad de ADN genómico para la secuenciación por NGS.
- Preparación de librerías genómicas: Se utilizó el kit Nextera DNA Sample (Ref. ILLUMINA Cat. No. GAO9115), cuyo procedimiento comprendió las siguientes etapas: a. Fragmentación del ADN genómico: se utilizó 50 ng de ADN genómico no degradado (ratio de absorbancia 260/280 nm entre 1.8 y 2) para la incorporación de tags específicos y secuencias tipo barcodes que permiten su posterior amplificación. b. Amplificación por PCR: para la amplificación de fragmentos se utilizáron adaptadores específicos proveídos en el kit NEXTERA (BARCODE combinations) c. Normalización de librerías: se normalizó la concentración de ADN y se visualizó la calidad de fragmentos generados previa su secuenciación con la tecnología ILLUMINA. Previa la normalización se realizó una cuantificación de las librerías qPCR en un lector KAPA-BIOSYSTEMS. d. Control de calidad de librerías: se utilizaró el kit del BIOANALIZER (AGILENT TECH 2100) el cual utiliza un chip para estimar el tamaño y concentración de fragmentos de las librerías de ADN. Se utilizó el kit de KAPA-BIOSYSTEMS (Library Quantification Kit) para obtener una cuantificación precisa de las bibliotecas previa su secuenciación NGS.
- Secuenciación por NGS: se utilizó la tecnología de ILLUMINA con el equipo MISEQ para la secuenciación de las librerías obtenidas. Se utilizó un cartucho de 500 (2 x 250) para obtener lecturas en Paired ends (doble sentido) para cada librería de DNA de cada cultivo.
- Análisis bioinformático: los datos de las corridas se almacenaron en el servidor del CIRAD. El análisis inició con la obtención de los archivos de salida del secuenciador MISEQ los cuales se generan en formato FastQ comprimidos (*.fastq.gz) para cada libreria analizada. Para cada librería se obtuvo dos archivos de salida FastQ (una para cada sentido). Se realizó un análisis FastQC para el Control de calidad de los datos NGS generados en la secuenciación. De este análisis se generó para cada librería un reporte con estadísticas y gráficos de parámetros tales como Calidad de secuencia por base (per base sequence quality-PbSQ), Contenido de secuencia por base (per base sequence content-PbSC), secuencias sobre representadas (overrepresented sequences-OS). Una vez realizado el control de calidad de datos, se utilizó un pipeline en LINUX para la identificación de contigs con motifs SSR explotables en las librerías de ADN secuenciadas. Los resultados crudos (en formato FASTQ) se descargaron en el clúster de cálculo con la ayuda de los programas WING-X y PUTTY. En PUTTY se corríeron scripts para el ensamblaje de contigs usando el programa ABYSS y un pipeline para la búsqueda de motifs microsatélites con el programa MISA. Se incorporó como criterio de búsqueda: la búsqueda de motifs microsatélites con dos a cinco unidades de repetición y el tamaño de las secuencias flanqueantes de al menos de 100 pb a cada lado de la secuencia motif para el diseño de primers.
Bibliographic Citations
- Morillo E, Buitron J, Limongi R, Vignes H and Argout X. (2016). Characterization of microsatellites identified by Next Generation Sequencing in the Neotropical tree Handroanthus billbergii (Bignoniaceae). Applications in Plant Sciences 4(5): http://dx.doi.org/10.3732/apps.1500135
- MORILLO E. y BUITRON J. 2017. Generación de la tecnología de marcadores moleculares microsatélites para el genotipaje de especies nativas de interés. In. Memorias científicas del Congreso Internacional de Agricultura Sustentable. Pg. 31. UTC, Ecuador
Additional Metadata
| Alternative Identifiers | https://patrimonio.ambiente.gob.ec/iptmae_permisos/resource?r=librerias_ssr |
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