Análisis de transcriptóma de genotipos resistentes y susceptibles de genotipos de naranjilla infectados con Fusarium oxysporum y Meloidogyne incognita

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MORILLO E, BUITRON J, OCHOA J, Llumiquinga P (2025). Análisis de transcriptóma de genotipos resistentes y susceptibles de genotipos de naranjilla infectados con Fusarium oxysporum y Meloidogyne incognita. Version 1.2. Ninguna organización. Occurrence dataset. http://patrimonio.ambiente.gob.ec/iptmae_permisos/resource?r=transcriptoma_naranjilla&v=1.2

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Palabras clave

Transcriptoma; naranjilla; nematodos; fusarium; resistencia; Observation

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Datos del proyecto

El INIAP trabaja en el mejoramiento genético de la naranjilla desde dos frentes, el uno mediante la evaluación de la resistencia de especies silvestres a enfermedades, y un segundo en la evaluación de poblaciones de cruzamientos interespecíficos, buscando generar materiales con características de productibilidad y tolerancia/resistencia. Este estudio forma parte del proyecto AECID “FORTALECIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN PARA MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD Y CALIDAD DE LA NARANJILLA Y TOMATE DE ÁRBOL EN EL ECUADOR” (en anexo) y tuvo como objetivo realizar un análisis del transcriptoma en genotipos resistentes y susceptibles de naranjilla inoculados con Fusarium oxysporum y Meloidogyne con el fin de identificar genes que presenten diferentes niveles de expresión entre genotipos resistentes y susceptibles a estos dos patógenos. Para el estudio se estableció un ensayo experimental en la EESD-INIAP con 297 plantas obtenidas por micropropagación. Para cada genotipo en estudio (S. hirtum (F56), S. hyporodium (T1P6), S. quitoense (Q1 y Q2) y segregantes (N8-48, N8-51 y N8-59) se inocularon dos plantas con cada patógeno, como testigos se dejaron dos plantas sin inocular. Se obtuvieron 46 muestras de ARN seleccionadas para la secuenciación NGS. Para nematodos se seleccionaron 18 muestras correspondientes a S. hyporodium y S. quitoense (sin espinas) en cada momento establecido (M1-M3). Para cada genotipo se incluyeron dos plantas inoculadas (replicas biológicas) y un testigo (sin inocular). Adicional se incluyó una muestra de S.hirtum inoculada en M1. Para Fusarim se seleccionaron 27 muestras: S. hyporodium, S. quitoense (sin espinas) y una planta proveniente de la cruza S. hyporodium x S. quitoense, en cada momento establecido (M1-M3). Igualmente para cada genotipo se incluyeron dos plantas inoculadas (réplicas biológicas) y un testigo (sin inocular).

Personas asociadas al proyecto:

Métodos de muestreo

Para nematodos se realizó la inoculación a una densidad de 7500 huevos por planta. La toma de muestras (raíces) se realizó en nitrógeno líquido 36h, 7 y 45 días desde la inoculación. Para cada genotipo se realizó la toma de muestra (raices) en dos plantas inoculadas y una sin inocular (testigo). Las muestras tomadas se conservaron en laboratorio a -80ºC hasta la extraccion del ARN. Para el ensayo con Fusarium se tomaron muestras de las plantas inoculadas en los diferentes momentos establecidos para el ensayo (3, 5,10 y 14 días) . Las muestras tomadas fueron criopreservadas a 80ºC hasta la extracción del ARN en laboratorio.

Descripción de la metodología paso a paso:

1. Para la extraccion de ARN se empleó el reactivo Trizol (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las especificaciones del fabricante para este procedimiento. La calidad y cantidad del ARN se visualizó por electroforesis en geles de agarosa 2% y en un fluorímetro QUBIT con el kit RNA-HS Assay y por espectrofotometría en un equipo EPOCH. Validado el método de extracción se realizaron las extracciones de ARN de las muestras de tejido de plantas inoculadas con Fusarium y nematodos en los diferentes tiempos establecidos en el ensayo experimental. La purificación del ARN se realizó con el kit PureLinkTM RNA Mini (Thermo Fisher Scientific, cat. 12183018A). Primero, las muestras se aforaron a 500 uL con agua etanol 75%. Se transfirió la muestra a la columna de purificación y se centrifugó por 30 segundos a 12000 rpm. Luego, se eliminó el desecho del tubo colector. Se agregó 700 uL de buffer de lavado I a la columna de purificación y se centrifugó a 12000 rpm durante 30 segundos. Después, se eliminó el desecho y se cambió el tubo colector. Se añadió 500 uL de buffer de lavado II a la columna de purificación y se centrifugó por 30 segundos a 12000 rpm. A continuación, se eliminó el desecho del tubo colector. Se volvió a colocar 500 uL de buffer de lavado II a la columna de purificación. Se centrifugó por 30 segundos a 12000 rpm y se eliminó el desecho del tubo colector. Se centrifugó la columna a 12000 rpm durante 1 minuto y se eliminó el tubo colector. Se colocó la columna en un nuevo tubo. Se añadió 30 uL de agua del kit en la columna de purificación; se incubó por 1 minuto a temperatura ambiente. Finalmente, se centrifugó a máxima velocidad por 2 minutos. Las muestras se cuantificaron y almacenaron a una temperatura de -80oC. Con los 46 ARNs seleccionados se realizó la construccion de librerias con el lit TruSeq Stranded mRNA de Illumina y se realizó la secuenciacion en modo paired-end para la obtencion de los datos transcriptomicos.

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