Cuantificación de la expresión de genes asociados a la calidad aromática en clones comerciales tipo Nacional de cacao del INIAP

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MORILLO E, BUITRON J, CRUZ T (2024). Cuantificación de la expresión de genes asociados a la calidad aromática en clones comerciales tipo Nacional de cacao del INIAP. Version 1.0. Ninguna organización. Occurrence dataset. https://patrimonio.ambiente.gob.ec/iptmae_permisos/resource?r=qpcr_cacao&v=1.0

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Ключевые слова

Cacao; calidad aromática; linalool; aroma floral; análisis de expresión; gen LIS

Контакты

Географический охват

GUAYAS, LOS RÍOS

Таксономический охват

N/A

Временной охват

Данные проекта

En el presente estudio se evaluó la expresión de este gen en clones comerciales de cacao Nacional mediante PCR cuantitativa. Se realizó la extracción de ARN de las almendras clones EET19, EET96, EET103 y CCN51 en la semana 20 y 22 de maduración y a las 24 y 48 horas de microfermentación de las localidades EETP y EELS del INIAPLa cuantificación relativa del gen LIS se realizó mediante el método ddCt. A partir del análisis de la expresión génica se determinó que los clones de cacao Nacional presentaron un mayor nivel de expresión del gen LIS con respecto al clon CCN51 en los tiempos de maduración y de microfermentación estudiados. Los resultados demostraron que existen diferencias significativas en el nivel de expresión del gen LIS entre los clones de cacao Nacional y los cuatro momentos de análisis. El clon EET103, que posee un aroma floral intenso, presentó el nivel más alto de expresión del gen LIS; mientras que el clon EET19, que posee un aroma floral ligero, presentó el nivel más bajo de expresión de este gen. Estas observaciones sugieren una posible correlación entre el nivel de expresión del gen LIS y la intensidad del aroma floral del cacao Nacional.

Методы сбора

El material vegetal se obtuvo de mazorcas autofecundadas de los clones EET19, EET96 y EET103 de cacao Nacional y del clon CCN51. Se cosecharon dos mazorcas por cada clon a las 20 y 22 semanas de maduración. Después se seleccionó una mazorca por cada clon y se tomaron 10 almendras de cada una de ellas. Adicionalmente, se tomaron 10 almendras de las mazorcas de 22 semanas y se sometieron a un proceso de microfermentación durante 24 y 48 horas. Una vez colectadas todas las almendras en estudio se picaron y se colocaron en tubos con el reactivo RNA later. Para el desarrollo del experimento se recolectó un total de 64 muestras, las cuales fueron almacenadas a -80°C hasta la extracción de ARN.

Описание этапа методики:

1. Extracción de ARN: La extracción de ARN se llevó a cabo mediante el uso del reactivo PureLink Plant RNA (Thermo Fisher Scientific). De cada clon se obtuvieron 10 tubos con almendras picadas. De cada tubo se tomaron 0,15 g y la mezcla se maceró con nitrógeno líquido en un mortero. Se transfirieron 100 mg del macerado en tubos de 2 mL y se añadieron 500 µL del reactivo PureLink Plant RNA. Se realizaron dos purificaciones a las muestras de ARN: la primera se realizó con el fin de eliminar restos de ADNg y la segunda para eliminar residuos de lípidos y polifenoles. Cuantificación de ARN: La cuantificación del ARN purificado se realizó mediante espectrofotometría en el equipo EPOCH™ empleando el programa GEN5 Para ello se tomaron 2 µL de cada muestra y se colocaron en la microplaca del equipo. Se realizaron 2 lecturas de absorbancia a 260 nm y 280 nm, y a partir de estas mediciones se obtuvieron los valores de concentración. El índice de pureza se determinó a partir de la relación A260/A280. Una vez que se efectuó la cuantificación, se realizaron diluciones de las muestras hasta alcanzar una concentración final de 4 ng/µL. Síntesis de ADN complementario: La reacción de transcripción inversa se efectuó a partir del templado de ARN, para lo cual se empleó el kit Super Script IV First Strand Synthesis System (Thermo Fisher Scientific). Ensayo de validación de primers por PCR convencional: Se emplearon 5 primers para la amplificación del gen LIS, y 1 primer para la amplificación de cada uno de los genes de referencia: eIF-4a, MDH-P y SAND. En el ensayo se utilizaron las secuencias de los primers reportadas por Vancampenhout (2018) para la amplificación de los genes de referencia antes mencionados. Para la amplificación de los primers se utilizó una temperatura de alineamiento de 60oC, la cual fue reportada como óptima en el estudio de Vancampenhout (2018). Estandarización de la técnica de PCR cuantitativa: Los ensayos de PCR cuantitativa se realizaron mediante el uso del kit GoTaq® qPCR Master Mix y el protocolo descrito por el fabricante (Promega). Las reacciones se llevaron a cabo en el termociclador Agilent Mx3005P empleando el software MxPro (versión 4.10) y el sistema de detección SYBR Green. Ensayo de validación de primers mediante PCR cuantitativa: Se ensamblaron 5 reacciones para la amplificación de los primers: MDH-P, SAND y Lin 3. En el ensayo se utilizaron las muestras de ADNc, y un control positivo de ADNg de cacao Nacional. Establecimiento de las condiciones de reacción: El establecimiento de las condiciones de reacción de la PCR cuantitativa consistió en determinar la concentración óptima para la amplificación de los primers SAND y Lin 3 a 60°C. Para definir la concentración óptima de primer se evaluaron dos concentraciones 0,25 µM y 0,50 µM. Confirmación del gen LIS mediante secuenciación: Para verificar que el fragmento amplificado con el primer Lin 3 corresponde al gen LIS de cacao, se clonó el ADNc en el vector pGEM-T mediante el sistema Promega. El ADN de interés se envió a secuenciar en los laboratorios de Investigación de la Universidad de las Américas. La secuencia obtenida se alineó en el algoritmo BLAST para confirmar que el fragmento amplificado corresponde al gen LIS de cacao. Cuantificación relativa del gen LIS: Se ensamblaron tres reacciones para la amplificación del primer Lin 3 y una reacción para el primer SAND. Las reacciones se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos utilizando el mix de amplificación y el programa de qPCR previamente estandarizado. Se diseñaron 4 placas para la amplificación de todas las muestras en estudio. Los datos de fluorescencia se procesaron en el software del termociclador y los Ct correspondientes a cada reacción se exportaron a una hoja de cálculo de Microsoft Excel. La cuantificación de la expresión relativa se realizó mediante el método ddCt. La cuantificación relativa se llevó a cabo mediante el uso de dos calibradores distintos: el cacao CNN51 debido a que no posee el aroma floral característico del cacao Nacional y el cacao EET19 debido a que posee un aroma floral ligero. Los valores de la expresión relativa se linealizaron mediante una transformación logarítmica para minimizar la varianza que existe entre los datos, considerando la naturaleza exponencial de la curva de amplificación de la PCR cuantitativa. Diseño experimental Se realizó un diseño completamente al azar (DCA) con arreglo factorial 4x4x2 con un total de 32 tratamientos, y se utilizaron 2 réplicas biológicas por cada tratamiento. En el ensayo se analizaron 3 factores: la localidad, el clon y la condición (a la que se le denominó tiempo), y se tomó como única variable de respuesta el nivel de expresión del gen LIS. El factor localidad está compuesto por 2 niveles: la EETP y la EELS. El factor clon está compuesto por 4 niveles: los clones EET19, EET96 y EET103 de cacao Nacional y el clon CCN51. El factor tiempo está compuesto por 4 niveles: semana 20 y 22 de maduración y 24 y 48 horas de microfermentación. En el Anexo 5 se detallan los tratamientos que se utilizaron en el estudio .Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) y se aplicó la prueba de significancia Tukey. Los datos fueron analizados en el paquete estadístico SPSS (versión 23).

Библиографические ссылки

1. Vancampenhout, W. (2018). From Theobroma cacao L. bean to RT-qPCR: optimization of RNA extraction and selection of reference genes. Recuperado el 13 de enero de 2020 de https://lib.ugent.be/catalog/rug01:002482019.

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