Enriquecimiento funcional de comunidades microbianas de suelos de cultivos horto-frutícolas del Austro: diseño, establecimiento y efectos en el desempeño vegetal

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Chica E, Peña D, Yarzabal L, Ortiz W, Yunga T, Calle D, Curillo D (2023). Enriquecimiento funcional de comunidades microbianas de suelos de cultivos horto-frutícolas del Austro: diseño, establecimiento y efectos en el desempeño vegetal. Version 1.0. No organisation. Occurrence dataset. http://patrimonio.ambiente.gob.ec/iptmae_test/resource?r=enriquecimiento-funcional-de-comunidades-microbianas&v=1.0

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關鍵字

Biocarbono; consorcios microbianos; Mulch; análisis DGGE; bioinoculación; S. betaceum; Trichoderma spp.; endófito; promotor del crecimiento; M. rupestris; comunidades microbianas.

聯絡資訊

地理涵蓋範圍

El proyectó se desarrolló en la provincia del Azuay, las muestras fueron obtenidas de suelos de cultivos horto-frutícolas del Austro. El diseño de consorcios microbianos, su caracterización, establecimiento así como su desempeño fueron evaluadas en el Laboratorio de Biología Molecular y Micropropagación de la Universidad de Cuenca.

計畫資料

El uso de inoculantes biológicos ha ido creciendo de manera constante como una alternativa al uso de pesticidas y fertilizantes sintéticos. Sin embargo, su destino en el ambiente despues de la inoculación y su impacto en el microbioma nativo ha sido poco estudiado. En este proyecto varios inoculantes comerciales fueron aplicados en la rizosfera de dos cultivos (tomate, tomate de árbol y joyapa) para determinar si los microorganismos inoculados afectaron al microbiona local y por cuanto tiempo los microorganismos introducidos eran detectables en extractos de ADN de estos suelos. DGGE y secuenciación por tecnología Ion torrent fueron utilizados para anlizar la diversidad de microorganismos de estos suelos. Los resultados muestran que el impacto de los inoculantes en las comunidades de microoriganismos de estos suelos fue baja y que después de pocos días era prácticamente imposible detectar secuencias de los microorganismos inoculados.

取樣方法

-Evaluación de consorcios microbianos sobre el desarrollo de cultivo de tomate (Solanum lycopersicum) Las semillas de tomate fueron sembradas en bandejas germinadoras de polietileno, cuando las plántulas llegaron a una altura de 15 cm fueron trasplantadas en macetas de polietileno de 6 L de volumen. Las plantas de tomate fueron inoculadas cada 15 días con una cantidad de 50 ml de consorcio microbiano por planta, el mismo que fue formulado a base de Trichoderma spp, Lecanicillium spp, Beauveria bassiana, Bacillus spp, Paecilomyces spp y Pseudomonas fluorescens. Los cuales fueron diseñados en el laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca. La aplicación se realizaba manualmente en cada uno de los tratamientos (Tabla 2), distribuyendo los 50 ml de la solución microbiana alrededor de la planta en fracciones iguales, dando un total de 1.5 litros de solución microbiana. Este proceso se realizó durante todo el ciclo del cultivo. -Cambios en comunidades microbianas de la rizósfera de Solanum betaceum frente enriquecimiento de la microbiota edáfica nativa con consorcios microbianos Se seleccionaron los hongos Beauveria bassiana, Paecelomyces spp. y Trichoderma spp., con los cuales se prepararon mezclas en suspensión (consorcios microbianos). Selección realizada en base a estudios previos de proyectos de investigación realizados por el equipo de trabajo del Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad de Cuenca. La recolección de muestras se empezó en octubre del 2019, cuando el cultivo correspondía a una plantación homogénea en fase productiva. Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado en el cual se seleccionaron unidades experimentales compuestas por tres plantas consecutivas de características similares dentro de una misma fila de cultivo. Se evaluó un solo tratamiento que consistió en la aplicación mensual de un consorcio de microorganismos benéficos. Como control se utilizaron plantas que no recibieron la aplicación del consorcio. Ambos grupos recibieron el mismo tratamiento agronómico en lo que respecta a riego, fertilización y control de problemas sanitarios foliares. Para el estudio metagenómico se recolectaron muestras al inicio del experimento previo a la primera inoculación (D1) y a los 120 días posteriores a ésta (D120). Para evaluar la persistencia de los microorganismos introducidos (Trichoderma spp.) se recolectaron muestras previo a la primera inoculación y a los 90 y 210 días posteriores a ésta. En cada muestreo se recolectó una cantidad aproximada de 10 g de suelo rizosférico por cada una de las plantas experimentales, éstas fueron colocadas en tubos de polipropileno y trasladadas en una hielera al laboratorio y donde fueron almacenadas a -20°C hasta realizar las extracciones de ADN. -Caracterización de la comunidad de hongos endófitos asociados a la raíz de joyapa (Macleania rupestris) y evaluación del efecto de cepas cultivables en el desarrollo de plántulas. Las muestras de suelos fueron recolectadas de las raíces de la joyapa, en etapa de plántulas, siguiendo el método de muestreo de (Barillot et al., 2013), que consiste en excavar una profundidad aproximada de 30cm para la obtención de las muestras. El suelo circundante se extrajo parte de las raíces de las plántulas de joyapa seleccionadas en campo y estas raíces se agitan vigorosamente por 10 min para recolectar el suelo que se desprende de ellas. Las muestras de suelo rizosférico fueron obtenidas manualmente al sacar el suelo que quedó adherido a las raíces de las plántulas. Las muestras de suelo recolectadas por separado se tamizaron y almacenaron en bolsas de plástico en la oscuridad a 4 °C aproximadamente, usando hielo. Las muestras se transportaron al laboratorio y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.

方法步驟描述:

1. -Evaluación de consorcios microbianos sobre el desarrollo de cultivo de tomate (Solanum lycopersicum) El ADN metagenómico de cada muestra recolectada se consiguió por extracción a partir de 0.25 gramos de suelo, usando el protocolo desarrollado por Laurent et al. (2001) (Anexo 1), y modificado en el laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca. Se verificó el éxito de la extracción del ADN total mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) con amortiguador TAE 1X. Las condiciones de separación fueron a 120 voltios por 30 minutos y finalmente se observó la amplificación en un foto-documentador (E-Gel® Imager System, Invitrogen). En la PCR de hongos el ADN metagenómico aislado se usó como molde para amplificar, mediante Touchdown PCR la región ITS ADNr de la comunidad fúngica; para ello se utilizaron cebadores universales ITS1F (5'-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3'), e ITS4 (5'- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') (Tabla 2), que amplifican una región de aproximadamente 1400 pb. La amplificación se realizó en un Termociclador Mastercycler® nexus GSX1, Eppendorf con el perfil descrito en (Liu et al., 2015). Del producto de la primera amplificación se realizó un segundo PCR (PCR anidado) utilizando los cebadores ITS1FGC (5'-CGC CCG CGC GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCT TGG TCA TTT AGA GGA AGT AA -3') e ITS2 (5'- GCT GCG TTC ATC GAT GC-3'). El volumen final para cada reacción fue de 50 μl (Tabla 3). El perfil térmico programado para la amplificación se reaizó de acuerdo a Wu et al., 2013. En la PCR de bacterias el ADN metagenómico aislado se utilizó como molde para amplificar por PCR un fragmento interno del gen ADNr 16S que codifica la región variable V6 y V8 de aproximadamente 420 pb. Se utilizaron cebadores universales F968 (5'- GC-CGC CCG CGC CCC GCG CCC GGC CGC CCC CGC CCC AAC GCG AAG AAC CTT AC -3' y 1401R (5'- CGC CCG CGC CCC GCC CGG CCC GCC CCC GCC CCA ACG CGA AGA ACC TTAC -3'). Para la amplificación se utilizó los componentes de Platinum® PCR SuperMix, para un volumen total de 50 μl. Se utilizó el perfil térmico descrito por (Brons & Van Elsas, 2008). En todas las reacciones se incluyó una muestra sin ADN metagenómico como control negativo de amplificación. La amplificación por PCR de la región ITS ADNr y del gen 16S ADNr se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (w/v) con buffer TAE 1X. Las condiciones de separación fueron a 80 voltios por 30 minutos. Para conocer los tamaños moleculares de las bandas se utilizó un marcador de longitud molecular (TrackIt 1Kb plus DNA Ladder, Invitrogen); se observó y foto-documentó los geles utilizando un transiluminador (E-Gel® Imager System, Invitrogen). Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE): Para la corrida electroforética en ambos casos se preparó y ensambló el equipo DCode™ Universal Mutation Detection System (Bio-Rad), siguiendo las instrucciones descritas por (Janse et al., 2004). El gradiente químico desnaturalizante se preparó utilizando urea-formamida siguiendo las indicaciones descritas por (Muyzer et al., 1993); en el caso de los hongos se preparó y cargó el gel de poliacrilamida al 8 % (w / v) de acrilamida: bisacrilamida (37.5: 1) en un tampón TAE 0,5X con diferentes gradientes desnaturalizantes de urea/formamida. Las soluciones contienen desde 20% a 35% de desnaturalizante [donde el 100% desnaturalizante contiene urea 7 M y 40% (v / v) de formamida]. Igualmente, con las mismas condiciones se preparó el gel para las bacterias con poliacrilamida al 7 % (w/v) de acrilamida: bis acrilamida (37.5: 1) en un tampón TAE 0.5X con diferentes gradientes desnaturalizantes de urea-formamida. Transcurrido el tiempo de la corrida electroforética, los geles fueron teñidos utilizando SYBR Green 2X en tampón TAE 0.5X durante 30 minutos, a temperatura ambiente en un lugar oscuro; posteriormente las imágenes se visualizaron y documentaron con un transiluminador Molecular Imager® Gel Doc™XR+ Imaging System para su posterior análisis. A través del procesamiento de imágenes de los perfiles de DGGE en el programa bioinformática PyElph se calculó la riqueza de unidades taxonómicas operacionales (UTOs). Los resultados de la composición de bacterias y hongos fueron representados en forma de dendogramas realizando un análisis de agrupamiento jerárquico a partir de la matriz de similitud de Jaccard usando el algoritmo de ligamiento completo (Palacio et al., 2020). Diseño Experimental. El experimento se implementó utilizando un diseño experimental de bloques completos al azar con 12 tratamientos y cinco repeticiones, con un arreglo factorial de (3 x 2 x 2). La unidad experimental estuvo representada por un maceta con una separación entre plantas de 50 cm, dando un total de 60 unidades experimentales. Posteriormente se estudiaron las características de los datos en relación con la normalidad de su distribución (prueba de Shapiro-Wilk) y homogeneidad de varianzas entre tratamientos (prueba de Levene). Para determinar las diferencias estadísticas entre los tratamientos se utilizaron análisis de varianza (ANOVA). En los casos en que la distribución de las variables no fue normal, se aplicó la prueba de Friedman para comparar las medianas de ambos tratamientos.
2. -Cambios en comunidades microbianas de la rizósfera de Solanum betaceum frente enriquecimiento de la microbiota edáfica nativa con consorcios microbianos. Extraccción ADN genómico: Para caracterizar e identificar la comunidad microbiana asociada con la rizosfera del S. betaceum, el flujo de trabajo inició con la extracción del ADN genómico utilizando el kit PowerSoil (QIAGEN). La calidad y concentración fueron cuantificadas mediante fluorometría con el kit de Qubit™ dsDNA HS and BR Assay (TermoFisher) y por espectrofotometría. Preparación de librerías y secuenciación metagenómica: se aplicó el protocolo de Nanopore Native barcoding genomic DNA (versión: NBE_9065_v109_revJ_23May 2018) con los kits Native Barcoding Expansion 1-12 (EXPNBD104, éste fue sustituido por EXPNBD103) y 13-24 (EXP-NBD114), proporcionado por Oxford Nanopore Technologies (ONT) con el kit Ligation Sequencing (SQK-LSK109). La librería resultante se secuenció con MinION Mk 1B usando una celda de flujo R9.4.1, FLO-MIN106. los datos sin procesar en formato fast5 fueron utilizados para realizar el basecalling en tiempo real en el software MinKOW v 21.06.10. (Guppy v. 3.4.5 integrado) en modo de super alta precisión (minimum qscore=10). Los datos resultantes de este último proceso fueron utilizados para la asignación taxonómica en la plataforma de análisis de datos en línea EPI2ME (WIMP v3.3.2) basada en la nube de Oxford Nanopore Technology (ONT) empleando la base de datos del NCBI. Análisis estadístico. El análisis estadístico se llevó a cabo en R v.4.1.0, mediante los paquetes Vegan 2.5–7 (Oksanen et al., 2020), Microbiome v1.16.0 (Lahti & Shetty, 2012), Limma v 3.50.3 (Ritchie et al., 2015). Para evaluar y comparar la diversidad estructural de la comunidad microbiana de la rizósfera de S. betaceum, se calcularon los índices de Shannon-Weiner y Simpson, la riqueza se estimó con Chao1 y la dominancia con el índice del inverso de Simpson (Chao, 1984; Gini, 1912; Shannon & Weaver, 1949; Simpson, 1949). Para la comparación de la diversidad de la comunidad microbiana entre muestras y tratamiento, se aplicó el análisis PERMANOVA (PERmutational Multivariate ANalysis Of VAriance) (Anderson, 2017). Sea realizó un estudio para evaluar la persistencia de los microorganismos introducidos (Trichoderma spp.) en la rizósfera de S. betaceum para esto se hizo un aislamiento y caracterización morfológica de cepas. Posteriormente se realizó una extracción de ADN de los aislados. Para la extracción de ADN se siguió el protocolo de (Moťková & Vytřasová, 2012) con modificaciones. Trichoderma spp fue monitoreada en diferentes momentos durante el desarrollo del proyecto, para lo cual se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la cual se realizaron ensayos para validar las condiciones y primers. Se amplificó la región ITS1-ITS2 utilizando los primers específicos para Trichoderma spp. uTf (5’- AACGTTACCAAACTGTTG-3’) y uTr (5’-AAGTTCAGCGGGTATTCCT-3’) diseñados y comprobados por (Hagn et al., 2007) , esperando un fragmento de 540 pb. Las condiciones de corrida de la cámara de electroforesis fueron 100 voltios por 30 min, los fragmentos de ADN fueron visualizados con un foto-documentador con luz ultravioleta.
3. -Caracterización de la comunidad de hongos endófitos asociados a la raíz de joyapa (Macleania rupestris) y evaluación del efecto de cepas cultivables en el desarrollo de plántulas. La extraccion de ADN de los suelos se realizó con el kit DNeasy PowerSoil Pro Kit (Qiagen, Hilden, Germany), en cuanto a la calidad y concentración de ADN obtenido, estos parámetros se evaluaron mediante el fluorométro QubitTM 4.0 (Thermo Fisher Scientific, 2018). Para caracterizar e identificar la comunidad microbiana asociada con el suelo circundante y rizosférico de M. rupestris, se llevó a cabo la secuenciación mediante Nanopore MinION Oxford(Leggett & Clark, 2017). Las bibliotecas para la secuenciación de MinION se prepararon sin corte utilizando el kit de secuenciación de ligadura 1D (SQK-LSK109), y el ADN se codificó con el kit de expansión de código de barras nativo (EXP-NBD103) (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, Reino Unido). Se utilizó el flujo de trabajo pipeline EPI2ME (WIMP rev. 3.2.3) de la tubería basada en la nube de Oxford Nanopore Technology (ONT) para recuperar el análisis de información hasta el nivel de género. Análisis estadístico: La diversidad α de la comunidad se estimó utilizando los índices de diversidad de Shannon, Simpson y Chao1. La diversidad beta se estimó usando la disimilitud de Bray-Curtis, empleando la función vegdist del paquete vegano en R. Luego, se usó un análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA) para comparar la estructura de la comunidad microbiana entre el suelo circundante y rizosférico; esto se realizó con 999 permutaciones usando la función adonis del paquete vegano en R. El aíslamiento de hongos endófitos se realiza a partir de las raíces de M. rupestris previamente recolectadas y conservadas a 4 °C. La extracción de ADN genómico se realizó usando el protocolo modificado de Cenis (1992). Para la identificación de las cepas fúngicas aisladas, a partir del ADN extraído se amplificó del fragmento de la región ITS utilizando los cebadores ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3') (White et al., 1990) y LR0R. (5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3') y LR3 (5'-CCGTGTTTCAAGACGGG-3') (Vilgalys & Hester, 1990). Los fragmentos fueron amplificados mediante una reacción de polimerización en cadena (PCR). Los productos de PCR fueron secuenciados por un proveedor de servicios externo (Macrogen Inc., Corea del Sur). La búsqueda de similitud se realizó utilizando BLASTn para encontrar las coincidencias más cercanas en GenBank. Este procedimiento reveló suficientes afinidades taxonómicas (≥98 % de identidad de secuencia) para todos los aislamientos (Altschul, 1997). Para la germinación de semillas y obtención de plántulas se recolectaron frutos semi-maduros de joyapa entre los meses de enero – marzo, estos son desinfctados y posteriormente en la cabina de flujo laminar, se extrajeron las semillas con la ayuda de una jeringa y se colocaron en una solución de AG3 2000 ppm por 24 h. Posteriormente las semillas se colocaron en cajas petri por 8 semanas para su germinación y la obtención de plántulas. Las plántulas obtenidas fueron colocadas en turba estéril para los ensayos de inoculación con los hongos aislados a partir de las raíces de M.rupestris. Un total de seis hongos aislados fueron seleccionados para evaluar su efecto en el desarrollo inicial de plántulas de M. rupestris. Luego de dos semanas de adaptación de la plántulas en la turba estéril, se realizó la inoculación de las diferentes cepas de hongos aislados. El ensayo de crecimiento de las plántulas se realizó en condiciones controladas en un cuarto de crecimiento y se mantuvo durante 3 meses bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 de obscuridad a 25 ± 2ºC con 10 plántulas individuales para cada hongo endófito aislado y el grupo control. Se registro el patrón de crecimiento del número de raíces y la altura de las plántulas a los 30, 60 y 90 días. Se utilizaron análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para evaluar los efectos de la inoculación de los hongos aislados en cuanto al número de hojas y la altura de las plántulas de M. rupestris. Se realizó la prueba post hoc de Tukey HSD (P ≤ 0.05) para probar la existencia de diferencias estadísticas para el mismo parámetro entre plántulas inoculadas por diferentes hongos.

引用文獻

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